Quy trình tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidaza tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường typ 2

Ngày: 30/07/2024 | 434

Bằng độc quyền giải pháp hữu ích số 3427 “Quy trình tinh sạch hoạt chất ức chế α- glucosidaza tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường typ 2” đã được Cục Sở hữu trí tuệ cấp cho PGS.TS. Đỗ Thị Tuyên và các đồng nghiệp thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KHCNVN ngày 25/12/2023. Giải pháp hữu ích đề cập đến quy trình tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidaza tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường typ 2. Cụ thể là quy trình chế tạo chế phẩm 1- deoxynojirimycin từ chủng B. subtilis EBL1 phân lập tại Việt Nam, trong đó quy trình này bao gồm các bước: a) lên men sinh tổng hợp hoạt chất; b) tinh sạch sơ bộ hoạt chất DNJ; c) tinh sạch thu hoạt chất DNJ và d) tạo sản phẩm bằng cách kết tủa trong cồn tuyệt đối.

Enzym α-glucosidaza (EC 3.2.1.20) (α-glucoside hydrolaza, α- 1,4- glucosidaza, glucohydrolaza α- D- glucoside) là một enzym thủy phân carbonhydrat ngoại phân tử (exo-typ carbohydraza) giải phóng glucozơ ở đầu không khử của cơ chất. Đây là enzym liên kết màng và có mặt ở vi sinh vật, thực vật và mô động vật. Enzym α- glucosidaza ở người nằm trong đường viền của búi ruột non có khả năng phân giải các liên kết α (1→4) glucosit. Enzym α- glucosidaza có thể phân giải tinh bột và disacarit thành glucozơ. Các thuốc điều trị đái tháo đường typ 2 chủ yếu tập trung vào nhóm chất có hoạt tính ức chế α- glucosidaza như: acarboza, miglitol, vogliboza, 1-deoxynojimycin.

Hoạt chất 1-deoxynojirimycin (DNJ) là hợp chất hydrocacbon có công thức cấu tạo là C6H13NO4, ức chế cạnh tranh, thuận nghịch của enzym α- glucosidaza trong ruột, do tác dụng của thuốc, glucozơ ở ruột sẽ được hấp thu chậm hơn, rải rộng ra nên tránh được hiện tượng tăng đường huyết sau khi ăn. Hoạt chất DNJ có khả năng kìm hãm mạnh các men oligo-sacaridaza, disacaridaza (Schmidt et al. 1979), trehalaza (Murao and Miyata 1980) ở ruột của động vật có vú. DNJ giống như một piperidin alkanoid có khả năng ức chế men α- glucosidaza, có hiệu quả chống lại sự tăng đường huyết, ngăn cản quá trình tân tạo glucozơ tại thành ruột và gan từ đó giảm lượng glucozơ đi vào máu (Murao and Miyata 1980). Chất này được miêu tả như moranolin (1,5- dideoxy-1,5 imino glucitol), là tiền chất quan trọng để tổng hợp miglitol (Matusumuka et al. 1979).

Bên cạnh những nghiên cứu cơ bản về hoạt chất DNJ từ thực vật, động vật và vi sinh vật, hiện nay một số nghiên cứu về tinh sạch hoạt chất DNJ đã được công bố. Như một nghiên cứu trên chủng Bacillus lentimorbus đã được chứng minh là có khả năng ức chế α- và β- glucosidaza khi nuôi trong môi trường chứa 0,25% natri glutamat và 0,5% glucozơ, pH 8,0 ở 30°C, 48 giờ. Hoạt chất ức chế α- glucosidaza này được xác định là tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ và bền nhiệt. Ngoài chất ức chế α-glucosidaza, chủng này cũng tạo ra chất ức chế β- glucosidaza trong cùng môi trường nuôi cấy và chất ức chế này cho thấy hoạt tính chống vi khuẩn chống lại Botrytis cinerea. Trong khi việc sản xuất chất ức chế α- glucosidaza bị giảm bởi nồng độ glucozơ cao hơn 1%, việc sản xuất chất ức chế β- glucosidaza không bị ảnh hưởng bởi nồng độ glucozơ cao hơn 20%. Chất ức chế α- glucosidaza từ dịch lọc nuôi cấy của chủng này được tách ra khỏi chất ức chế β- glucosidaza thông qua sắc ký cột Sephadex G-100 (Kyoung-Ja et al. 2002).

Ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu các chủng Bacillus sp. để sản xuất DNJ đang vẫn còn mới mẻ, Quyền Đình Thi và cộng sự đã tuyển chọn được bộ chủng Bacillus spp. sinh tổng hợp các chất ức chế α- glucosidaza. Trong nghiên cứu này nhóm tác giả mới chỉ tuyển chọn được các chủng sinh tổng hợp chất ức chế α- glucosidaza. Vũ Thu Hằng và cộng sự 2012 cũng đã bước đầu nghiên cứu tinh sạch chất ức chế α- glucosidaza bằng cột sephadex G75, tuy nhiên hiệu suất còn thấp, mới chỉ ở mức độ tinh sạch sơ bộ. Hoạt chất này khá bền nhiệt và có khả năng ức chế hoạt tính của các enzym maltaza, sucraza, amylaza và glucosidaza.

Như vậy, có thể thấy rằng các nghiên cứu về DNJ hoạt chất ức chế α- glucosidaza còn khá ít, đặc biệt là những nghiên cứu về tinh sạch và đánh giá khả năng giảm đường huyết của hoạt chất này còn chưa được nghiên cứu.

Mục đích của giải pháp hữu ích là khắc phục các thiếu sót nêu trên. Để đạt được mục đích đó, giải pháp hữu ích đề xuất đến quy trình tinh sạch hoạt chất ức chế α- glucosidaza tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường typ 2. Cụ thể là quy trình tinh sạch thu nhận hoạt chất DNJ từ chủng B. subtilis EBL1 tự nhiên phân lập tại mẫu đất ở Việt Nam, trong đó quy trình này bao gồm các bước:

a) Lên men sinh tổng hợp hoạt chất: chủng B. subtilis EBL1 sau khi được hoạt hóa -80°C trong môi trường YS (g/L) (2 cao nấm men; 10 tinh bột; 3 cao thịt; pH 7,3) được nuôi cấy trong môi trường lên men bao gồm (% khối lượng/thể tích): 1% tinh ngô bột; 0,5% bột đậu nành; 0,5% cao nấm men; 0,05% KH2PO4; 0,05% (NH4)2SO4; độ pH 7,5; trong 4 ngày, tốc độ 200 vòng/phút, 37°C. Dịch sau lên men được ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch, bỏ tủa.

b) Tinh sạch sơ bộ hoạt chất DNJ bằng cách đông khô lạnh mẫu với tỷ lệ 10:1. Mẫu được giữ ở -20°C. Mẫu đông khô được hòa tan trong nước với tỷ lệ 1:2 (mẫu:nước). Dịch này được tủa trong cồn với tỷ lệ 1:4 theo thể tích nhằm loại bỏ các polysacarit và protein. Dịch tinh sạch sơ bộ này được đưa qua màng thẩm tích có kích thước màng 100 Da và 1000 Da (MWC0).

c) Tinh sạch thu hoạt chất DNJ sạch: dịch sau khi qua màng (MWC0) đưa lên cột than hoạt tính (kích thước cột: 2,6x60cm, tốc độ dòng chảy 1,5 ml/phút) và sử dụng etanol 5-30% để thu các phân đoạn có chứa DNJ.

d) Tạo sản phẩm bằng cách kết tủa trong cồn tuyệt đối: Các phân đoạn chứa hoạt chất DNJ sạch được tập trung lại và kiểm tra TLC, thử hoạt tính ức chế α- glucosidaza. Dịch tinh sạch được tủa 2 lần trong cồn tuyệt đối nhằm kết tinh, hút chân không thu tinh thể DNJ.

Hiệu quả đạt được của giải pháp hữu ích

Quy trình theo giải pháp hữu ích đơn giản và dễ thực hiện. Chế phẩm DNJ thu được từ quy trình theo giải pháp hữu ích làm giảm glucozơ máu trên mô hình chuột đái tháo đường typ 2. Quy trình tạo sản phẩm DNJ đáp ứng được yêu cầu đặt ra là đơn giản, kinh tế, sử dụng các dung môi ít độc hại có thể ứng dụng trong sản xuất ở quy mô pilot.

Tư vấn, hỗ trợ đăng ký bảo hộ độc quyền các loại hình quyền Sở hữu trí tuệ tại Viện Hàn lâm KHCNVN: Phòng Thông tin, Truyền thông Khoa học và Sở hữu công nghiệp, phòng I 3.1, nhà A11, số 18 Hoàng Quốc Việt. TEL: 024.37562551 - 0904.252.152. Email: pqduong@isi.vast.vn.

Tin: Trần Thị Kim Ngân