Chủng vi nấm Penicillium citrinum HGN13C thuần khiết về mặt sinh học có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất podophyllotoxin

Ngày: 24/12/2024 | 5521

Bằng độc quyền giải pháp hữu ích số 3355 “Chủng vi nấm Penicillium citrinum HGN13C thuần khiết về mặt sinh học có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất podophyllotoxin” đã được Cục Sở hữu trí tuệ cấp cho TS. Trần Hồ Quang và các đồng nghiệp thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KHCNVN ngày 25/10/2023. Giải pháp hữu ích thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học liên quan đến chủng vi nấm Penicillium citrinum HGN13C sống nội sinh trong cây dược liệu, có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất podophyllotoxin, được sử dụng làm tiền chất để tổng hợp thuốc chống ung thư etoposit và teniposit cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược.

Trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các loại thuốc mới có độc tính trên nhiều dòng ung thư khác nhau, ít tác dụng phụ đang là ưu tiên hàng đầu. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam đặt nhiều quan tâm vào các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính chống ung thư. Từ các bài thuốc dân gian đến việc sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học, đến nay chúng ta đã có nhiều loại thuốc ung thư được thương mại hoá có nguồn gốc thiên nhiên.

Giải pháp hữu ích đề xuất chủng nấm nội sinh Penicillium citrinum HGN13C được phân lập từ bên trong các mô lá, thân, rễ, củ của cây dược liệu Bát Giác liên (Podophyllum tonkinense Gagnep) phân bố tại huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang, Việt Nam. Chủng này có khả năng sinh tổng hợp podophyllotoxin nhằm tạo nguồn sản xuất podophyllotoxin cho ngành công nghiệp dược. Các chất này được sử dụng làm tiền chất để tổng hợp sản phẩm tự nhiên chống ung thư etoposit và teniposit.

Chủng nấm thuần khiết về mặt sinh học, có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất podophyllotoxin và có khả năng ức chế tế bào ung thư với giá trị IC₅₀ từ 0,041- 20,79µg/mL, trong đó chủng này mang trình tự ADN vùng ITS1-18S-ITS2 có kích thước là 538bp được nêu trong SEQ ID NO:1.
Giải pháp đề cập tới chủng nấm Penicillium citrinum HGN13C thuần khiết về mặt sinh học, được phân lập từ bên trong các mô lá, thân, rễ, củ của cây dược liệu Bát Giác liên (Podophyllum tonkinense Gagnep) của Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp podophyllotoxin.

Chủng nấm trên được phân lập theo phương pháp của Arnold và cộng sự (2000) có cải tiến. Các bước tiến hành như sau:
-    Xử lý mẫu trước khi phân lập: Mẫu cây được rửa sạch bằng nước cất, khử trùng bằng etanol 70% trong 1-2 phút, tiếp theo rửa bằng NaOCl 5% trong 5 phút. Sau cùng mẫu được rửa trong nước khử khoáng vô trùng.
-    Mẫu sau khi xử lý, cắt mẫu thành từng phần nhỏ (0,2-1cm) ở các bộ phận khác nhau từ rễ, củ, thân, lá và được đặt lên đĩa petri chứa môi trường thạch nước (water agar 1,5%) có bổ sung kháng sinh Cefotaxim 200mg/ml. Các đĩa được nuôi ở nhiệt độ 25 ± 2°C cho đến khi bắt đầu phát triển khuẩn ty nấm. Cấy chuyển các hệ sợi nấm sang môi trường thạch khoai tây (PDA) ở cùng nhiệt độ, theo dõi và cấy chuyển đến khi thu được các chủng nấm thuần, giữ ở 4-10°C để lưu giữ và bảo quản chủng giống.

Các chủng nấm thuần khiết về mặt sinh học được phân loại bằng phương pháp truyền thống như nhận dạng chủng nấm qua màu sắc, hình dạng, kích thước, dạng mặt, dạng mép khuẩn lạc, màu sắc hệ sợi, màu sắc mặt dưới, giọt tiết, sắc tố khuếch tán ra môi trường, vách ngăn sợi nấm, bào tử và cuống bào tử,… theo các khóa phân loại để sơ bộ nhận dạng, phân loại các chủng nấm đến chi. Sau đó, tách chiết hệ gen của các chủng nấm thu được bằng kit tách chiết ADN genom G-spinTM Total ADN Extraction kit (INtRON, Korea) theo phương pháp sinh học phân tử và khuếch đại đoạn gen ITS1-18S-ITS2 bằng cặp mồi đặc hiệu ITS1 và ITS4. Tiếp theo, đoạn gen ITS1-18S -ITS2 thu được được xác định trình tự nucleotit bằng máy giải trình tự AEI PRISM @3700 Genetic Analyzer. Trình tự nucleotit được phân tích bằng phần mềm PCGENE và trình tự vùng được so sánh với cơ sở dữ liệu trên Ngân hàng gen (Genebank-NCBI) bằng công cụ BLAST SEARCH.

Các chủng nấm thuần khiết về mặt sinh học sau khi định danh được lên men và xác định khả năng sinh tổng hợp hoạt chất PDT. Chủng nấm thử nghiệm được nuôi cấy trong 1 lít môi trường PDA (Potato Glucose Agar): 2% D-glucoza (Đức); 1,8%(w/v) agar (Việt Nam); 20% (w/v) khoai tây; độ pH7 ở nhiệt độ 25°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 5 ngày, tiến hành lọc thu sinh khối nấm tươi và dịch lên men. Sinh khối được tách chiết bằng dung môi hữu cơ metanol, thu được dịch chiết nấm, chính là dịch chiết alkaloid toàn phần, dịch đem cô quay thu cặn chiết. Dịch lên men cô quay thu cao chiết. Cặn chiết nấm và cao chiết dịch lên men được đưa đi xác định khả năng sinh tổng hợp PDT bằng phương pháp sắc ký lỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PAD (PerkinElmer).

Bên cạnh đó, bằng phương pháp xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp được thực hiện theo phương pháp của Skekan et al. (1990). Sử dụng các dòng tế bào ung thư ở người, ở chuột và tế bào lành do GS.TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp. Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC₅₀ ≤ 20 µg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC₅₀ ≤ 5 µM [Hughes JP, (2011)].

Thực hiện việc phân lập và xác định các đặc tính sinh trưởng và phát triển nêu trên, giải pháp hữu ích đã thu được chủng thuộc chi Penicillium thuần khiết về mặt sinh học. Chủng này có trình tự đoạn gen ITS1-18S-ITS2 có kích thước 538bp như nêu trong SEQ ID NO:1 và có độ tương đồng 99,63% so với trình tự đoạn tương ứng của gen chủng Penicillium citrinum genomic DNA sequence contains ITS1 có mã số LT558895.1 trên ngân hàng gen và được định danh là chủng Penicillium citrinum HGN13C.

Chủng Penicillium citrinum HGN13C hiện được lưu giữ trong bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm KHCNVN.

Hiệu quả đạt được của giải pháp hữu ích

Chủng vi nấm Penicillium citrinum HGN13C được phân lập từ cây dược liệu Bát Giác liên (Podophyllum tonkinense Gagnep) phân bố tại huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang, Việt Nam, có khả năng sinh tổng hợp podophyllotoxin nhằm tạo nguồn sản xuất podophyllotoxin cho ngành công nghiệp dược ở quy mô lớn, góp phần giảm giá thành sản phẩm và bảo tồn nguồn nguyên liệu tự nhiên quý hiếm đang dần cạn kiệt. Các chất này được sử dụng làm tiền chất để tổng hợp sản phẩm tự nhiên chống ung thư etoposit và teniposit.

Tính đến nay, chưa có một công bố nào về vi nấm nội sinh cây Bát Giác liên ở Việt Nam. Giải pháp hữu ích đưa ra là một trong những chủng đầu tiên được nhóm nghiên cứu phân lập từ bên trong các mô lá, thân, rễ, củ cây Bát Giác liên phân bố tại huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang, Việt Nam và có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất podophyllotoxin. Chủng này thuộc loài mới chưa được công bố trên thế giới.

Tư vấn, hỗ trợ đăng ký bảo hộ độc quyền các loại hình quyền Sở hữu trí tuệ tại Viện Hàn lâm KHCNVN: Phòng Thông tin, Truyền thông Khoa học và Sở hữu công nghiệp, phòng I 3.1, nhà A11, số 18 Hoàng Quốc Việt. TEL: 024.37562551 - 0904.252.152. Email: pqduong@isi.vast.vn

Tin: Trần Thị Kim Ngân